夏のオリンピックでは、素晴らしい勝利の物語、決意、そしてアスリートの偉業が披露されます。アスリートたちは常にルールの範囲内で強みを求めていますが（ダイエットからハイパーボリック・チャンバー、凍結療法まで）、身体強化薬物（PEDs）は超えてはならない一線です。身体強化薬物は、国際オリンピック委員会、米国アンチ・ドーピング機構 そして 世界アンチ・ドーピング機構 によって、常に精査され、追跡され、検査されている。薬物や方法論は進化していますが、アナボリックアンドロゲンステロイド（AAS）オリンピックから ツール・ド・フランス, アイアンマン・トライアスロン、さらには クロスフィットゲームズ のようなニッチなスポーツに至るまで、今でも重要なパフォーマンス向上剤です。このブログでは、一般的なパフォーマンス向上薬物と、これらの薬物を検出するための対策について詳しく説明します。

運動能力強化薬とは

ステロイドとその代謝物、そしてテストステロンの構造的な理解は、その検出用の分析プロトコルを開発する上で重要です。テストステロン（T）は、天然に産生されるホルモンで、アンドロゲン受容体のネイティブリガンドです。この受容体がテストステロンや合成ステロイドなどのアンドロゲンと結合すると活性化され、筋力、骨密度、赤血球の生産量の増加など、望ましい運動能力向上効果が得られます。アスリートにとって筋肉や骨が強くなるのは当然の強みですが、赤血球の生産量が増えることでも筋肉や臓器に多くの酸素が供給され、エネルギーの生産と回復を促進します。従ってテストステロンは（合成および天然のいずれも）、アナボリックステロイドの基礎になっています。

アナボリックステロイドは、主に3つのカテゴリーに分類されます（下図1）。

• テストステロン誘導体
• 5α-ジヒドロテストステロン（DHT）誘導体
• 19-ノルテストステロン誘導体

図1：一般的なアナボリック・アンドロゲン作用のあるテストステロン誘導体、5α-ジヒドロキシテストステロン誘導体、19-ノルテストステロン誘導体と比較した、テストステロンの構造。

構造、基質活性、半減期の違いは、これらのアナボリック・アンドロゲン作用のあるテストステロン誘導体の生物学的特性に影響を与えます。特に誰もが自然にテストステロンを持っているため、こういったところでの違いこそが化合物を検出する方法を設計する上での基礎になります。

運動能力強化薬の検出方法

それぞれの薬物について、その主要な代謝物の特定が、尿、血液、唾液による直接的な診断検査を開発する第一歩となります。ヒトの体内では、天然の（内因性の）テストステロン（T）とエピテ ストロン（E）が約 0.4-2 の割合で生成されています（図 2A¹ 初期の検出方法では、尿検体中のテストステロンとエピテストステロンの比率を単純に測定するものなどでした。T/Eレシオが4を超えていると、外因性テストステロン製剤によるドーピングが疑われました。ラボで作られたTは内因性T2よりも¹³C:¹²Cの比がわずかに低いので、外因性Tの存在を確認するためには、ラボではTの¹³C:¹²Cの同位体比を測定します。この方法は、2006年のツール・ド・フランスでのフロイド・ランディス氏の起訴において、彼が実際に外因性テストステロンを使用していたことを証明するのに使用されました。

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何らかのステロイド系薬物が初めて運動競技に登場した場合、その検出と分析のために薬物の特性と代謝を理解することが規制当局に課せられた責務となります。1988年のソウルオリンピックで、短距離走者のベン・ジョンソンが100m走で世界記録を出した後、スタノゾロールの陽性反応が出て金メダルを剥奪された件が、これにあたります。この薬物の検出方法を開発するために、研究者はスタノゾロールの代謝を理解し、どうすれば最も高感度で検出できるかを把握する必要がありました。スタノゾロールの主な代謝経路を図2Bの縦の経路に、従来からあるガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）3による代謝物の検出に必要なサンプル処理とともに示しました。しかし、スタノゾロールは、図2Bの水平経路に示す17-エピ・スタノゾロール-N-グルクロニドという別の代謝物を少量産生します。この代謝物は長期間存続し、なんと投与後28日目でも検出できます。この代謝物からスタノゾロールを検出するために、エレクトロスプレーイオン化法（ESI）と液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）を組み合わせた複合的な方法が最近開発されました。つまり、こういった手法ではイオンが生成され、それは質量によって分離・同定できるため、そこに存在する代謝物の特性を明らかにし、同定することができるようになるわけです。

なぜ運動能力強化薬は継続的な問題なのか

2000年代初頭、科学者たちがアナボリック・アンドロゲン作用のあるステロイドを検出する技術の改良に忙殺されている間、バリー・ボンズはホームランを量産していました。その舞台の裏側で、ボンズをはじめとする選手たちが、強力なアナボリック作用を持ち、ドーピング防止検査規定を念頭に置いて特別に設計された、新しい合成ステロイド、テトラヒドロゲストリノン（THG）を使用していたことを、MLBはほとんど知りませんでした。これは「The Clear」と呼ばれるTHGというもので、ドーピング防止プログラムは当初その存在と代謝物を知らなかったため、尿から検出できませんでした。ところが調査の際に、使用済み注射器の残渣からTHGを抽出してその同定に成功しました。その後はスクリーニング用のLC-MS/MS法が容易に開発されました⁴。

この野球界のスキャンダルは、ドーピング防止プログラムにおけるAASの直接検出をめぐる問題の代表例です。第一に、スクリーニングのプロセスでは、既知の物質の既知の代謝物を探します。従って設備の整った組織なら、検出を逃れるためには、まだ見たことがない「デザイナーステロイド」を合成すればうまくいくわけです。さらに、検査手順が定められたとしていても、検査頻度が少ないと（年に2回検査を実施するMLBなど）、ステロイドの使用が検出されないことがあります。検査間隔が長いと、その間にステロイド代謝物の濃度が検出限界以下になるためです。また、発見されないようにアスリートが隠ぺい剤や利尿剤を使用することも可能です5。こうなると検査実施側はさらなる負担を強いられることになります。

ドーピング防止機構はこうした問題を認識していましたが、封じ込めに向けた取り組みをしていたにもかかわらず、運動能力強化薬は使用され続けてきました。1990年代にはすでに、外因性物質がない場合、尿中のテストステロン、その前駆体およびその代謝物の濃度と比率は著しく安定していること、アナボリック・アンドロゲンステロイドがこの安定した値に持続的に影響を与えることが研究で示されていました。しかし、この比率の異常値を検出するためにベイズ推定を採用したのは、2007年になってからです。これらの比率は、血液学的プロファイルとともに、アスリート生体パスポート（ABP）を構成します。このパスポートは、運動能力強化薬の検出能力を高める上での強力なベンチマークツールです。

運動能力強化薬、監視の今後の展開

In vitroバイオアッセイは、アンドロゲン検出のもうひとつの有望な非標的アプローチです。アンドロゲン応答配列の制御下にあるレポータータンパク質で細胞を変化させることにより、これらのアッセイは、そのソースに関係なくアンドロゲン受容体の活性化を検出することができます6。そのため、近年スポーツ選手が誤って禁止薬物を摂取する原因となっているサプリメントなど、組成が不明な試料中のアンドロゲンを検出する目的でもバイオアッセイは有用です。今後、それがステロイド性であっても、あるいはテストステロンと構造的に類似しておらず、そのためその代謝が把握されていない選択的アンドロゲン受容体モジュレータの新しいクラスの一部であっても、さらなる非標的生物活性に基づく検出方法の開発によって、新しいアンドロゲンを特徴付ける上で研究者の助けとなるでしょう⁷（図3）。

まとめ

オリンピック以降も、個人によるドーピング、時には組織の意向に沿ったドーピングのスキャンダルが起こることは間違いないでしょう。これもトップスポーツの特徴のひとつです。デザイナードラッグは、その性質上、臨床的な安全性試験が行われていないため、アスリートの健康を損なう恐れがあります。しかし、スポーツ団体が薬理学を駆使して創意工夫を続けているように、科学はドーピング防止機構に運動能力向上剤の検出に必要な知識と分析能力を提供し続けるでしょう。こうした分析能力を最大限に高めることが、ドーピングを最小限に抑え、スポーツ界における健康を促進し、公正さを保つ抑止力になるのです。

参考文献

1. Donike, M., Nachweis von exogenem Testosteron. Dt. Ärzte-Verl.: Köln, 1983; p S. 293-298.

2. Polet, M.; Van Eenoo, P., GC-C-IRMS in routine doping control practice: 3 years of drug testing data, quality control and evolution of the method. Anal Bioanal Chem 2015, 407 (15), 4397-409.

3. Schänzer, W.;  Opfermann, G.; Donike, M., Metabolism of stanozolol: identification and synthesis of urinary metabolites. J Steroid Biochem 1990, 36 (1-2), 153-74.

4. Catlin, D. H.;  Sekera, M. H.;  Ahrens, B. D.;  Starcevic, B.;  Chang, Y. C.; Hatton, C. K., Tetrahydrogestrinone: discovery, synthesis, and detection in urine. Rapid Commun Mass Spectrom 2004, 18 (12), 1245-049.

5. Alquraini, H.; Auchus, R. J., Strategies that athletes use to avoid detection of androgenic-anabolic steroid doping and sanctions. Molecular and Cellular Endocrinology 2018, 464, 28-33.

6. Lund, R. A.;  Cooper, E. R.;  Wang, H.;  Ashley, Z.;  Cawley, A. T.; Heather, A. K., Nontargeted detection of designer androgens: Underestimated role of in vitro bioassays. Drug Testing and Analysis 2021, 13 (5), 894-902.

7.Thevis, M.; Schänzer, W., Detection of SARMs in doping control analysis. Molecular and Cellular Endocrinology 2018, 464, 34-45.